北部DMRで実施したシークエンスセミナーの概要
１）９月２４日 午前
シークエンス採取の(1)目的として、①PCRで陽性となったものが目的とした遺伝子かの確認、②型別、③薬剤耐性変異の確認などがあること、(2)ダイターミネーター法とサイクルシークエンス反応の原理、(3)シークエンス採取のためのプライマー設計について説明した。
次に、3130シークエンサーについて、(4)運転前のメンテナンスと管理について説明した。
特に、ポリマーを2ボトルとして、1本をラン用に、1本をキャピラリーの保存用にわけ、ラン用のポリマーボトルは使用時以外には冷蔵保存して変質をさけること、3130の電源を入れる前に交換することを説明した。ポリマーラインの洗浄は、通常月1回実施することとした。
しばらく使用しない場合が想定され、その場合は一度ランをしてみてうまくいかなければポリマーラインの洗浄とポリマーの交換を実施することとした。
プライマーは日本でオーダーすると2日程度で送られてくると説明したところ、マンダレー医科大学の先生は、ミャンマーではタイのメーカーにオーダーを出すため、1ヶ月はかかるとのことだった。
２）９月２４日 午後
3130シークエンサーは、4本キャピラリーで36cmが装着されていた（使用していない50cmのキャピラリーもあった。）。
持参したサンプルはBigDye3.1のスタンダード試薬と、インフルエンザのM2遺伝子のサイクルシークエンス後のサンプルである。これらのランを実施したが、初回のランでは、その最中にUPSの電源供給がされていなかったことから停止し、再充電を待つこととなった。スタンダードのサンプルのデータが600ベース程度しか読めず、その後の波形の幅の拡幅が確認された。
しかし、36cmのキャピラリーでは通常700塩基は読めるが充分でなかったため、ポリマーの変質が疑われた。そこで、充電の間に、ポリマーラインの洗浄を実施し、持参したポリマーを充填した。またポリマーラインの洗浄方法を教示した。
３）９月２５日 午前
新しいポリマー環境でランを実施して、結果を確認したが、スタンダードのシグナルレベルは160程度、インフルエンザのサンプルは50から100程度といずれも低く、サンプルの変質が疑われた（保環研の3130で、新品のBigDye3.1のスタンダードの泳動時のシグナルレベルは570から980）。シグナルレベルが低いものの、スタンダードサンプルは、700ベースまで読むことができ、充分使用可能と思われた（36cmキャピラリーなので、600ベースがカタログ上の解読長）。
MEGAの使用法の説明は、ミーティングルームでPC画面をプロジェクターに映しての説明のみで、実際に各スタッフがPC操作しながらの研修ではなかったため、充分習得することは難しいと思われた。
持参したCDの中のインフルエンザM2遺伝子のシークエンスサンプルデータのトリミングとF及びRデータの結合を実施した。このデータをBLAST検索して、データをalignment explorerにダウンロードし、ClastalWのalignmentを実施してMEGAファイルを保存し、nj法による系統樹を作るところまで実施した。時間が短かったので、充分な理解は難しかったかもしれない。
セントラルのDMRでシークエンスを実施した際は、インターネットの接続PCがラボになかったため、BLAST検索はできなかった。BLAST検索がDMRで実施できたことは大きな進歩である。
インターネット環境について聞いてみたところ、各部署の事務室にはインターネットに接続したPCが1台ずつあるとのことで、MEGAを使用した解析ができると思われた。
４）感想と反省点
・シークエンスができるようになるには、①PCR、②陽性バンドを確認、③それを精製して④サイクルシークエンスを実施して、⑤精製後、⑥3130にセッティングして、データを得るながれを実際にやってみることが必要と思いました。
・高速冷却微量遠心機を抽出用として使用することから、コンタミ防止のためにPCR産物専用の卓上ミニ遠心機を使用するか（通しで実施していないので、産物からのコンタミ防止の説明ができていません。）、遠心機を使用しないベックマンコールターの精製キット：Agencourt Ampure XP, Agencourt Clean SEQが良いと思われました。
・キャピラリーの交換のメンテナンス、データのメンテナンスなども必要で、これらの説明ができませんでした。
・準備に時間がなく、短時間で説明するにはもう少ししっかりと準備が必要でした。
今回は、本当に基礎技術のセミナーでした。ラボも実際の稼働はこれからという状況でした。
ここには若くて多くの人材と広い施設があり、とりあえずの機器と材料や課題も豊富なことから、本格的に稼働するととても良いラボになると思います。ただ、DMRが具体的に何を課題にしてどう動いてミャンマーの人々の健康・医療に役立っていくのか、その構図が見えると良いのですが。そうすると、もう少し踏み込んだ支援ができるかと思います。
あとは試薬と消耗品に、サンプルがあればいろいろできそうです。
新潟県保健環境科学研究所ウイルス科 田村 務